Какви генетични дефекти се срещат в България?
В нашата страна до 2011 година генетичните дефекти, свързани с болестта, са изследвани и описани при 391 пациенти. Мутацията F508del се открива при 83% от тях, като в 40% тя е в хомозиготно състояние, а в останалите е в комбинация с друг молекулен дефект в гена. Едва при 16% от пациентите е намерена комбинация от редки генетични дефекти. Именно редките мутации представляват основен проблем при разработването на унифицирани диагностични стратегии при муковисцидоза. Друг проблем е, че при откриване на нова мутация в гена не винаги е възможно да се докаже или да се предвиди нейният ефект върху функцията му. Това налага обемни изследвания, включващи анализ на цялата кодираща и на регулаторните последователности на CFTR гена, за да се изключат и други възможни промени. В българската популация до сега са намерени общо 38 мутации, като освен F508del само четири други се срещат с честота над 2% – N1303K, G542X, 2183A A-G и R347P (Таблица 1)4. Останалите са редки или уникални дефекти, намиращи се в 17 от общо 27- те екзона на гена. За пръв път при български пациенти бяха описани и така наречените комплексни алели, съдържащи две различни мутации5. Те могат да упражняват и самостоятелно ефект върху генната функция и се очаква в комбинация да модифицират клиничните симптоми.
Интересен факт е, че има определени особености на разпределение на генетичните дефекти сред основните етнически групи в България. При българските пациенти втората по честота намерена мутация – N1303K е много характерна за популациите на Южна Европа и не е типична за тези от Средна Европа6. Други от дефектите (R1070Q, 1677 delTA) са регистрирани основно в черноморския регион и не се срещат в повечето Европейски страни7. При българските турци две от мутациите R347P и Q220X се откриват с характерна висока честота и е удачно да бъдат включени приоритетно при генетичните анализи. В ромските популации е описан само един молекулен дефект – F508del, който се среща при всички пациенти с този етнически произход. Този факт позволява за ромското население да бъде разработена ефективна профилактична скринингова програма, която няма да налага извършването на голям обем изследвания.
Природа на молекулните дефекти в CFTR гена и влиянието им върху неговата функция
Мутациите в CFTR гена засягат по различен начин неговия белтъчен продукт в зависимост от тяхната локализация и природа. Не всяка молекулна промяна в гена води до промяна на функцията му.
Таблица 1. Видове молекулни дефекти в CFTR гена, описани при българските пациенти и техните честоти и локализация.
№ Брой ре-
гистрира-
ни алели Мутация Локализация Честота %
1 2 129 G-C Интрон 1 0.26
2 1 Q2X + R3W Екзон 1 0.13
3 7 G85E Екзон 3 0.89
4 4 306del TAGA Екзон 3 0.51
5 1 R117H Екзон 4 0.13
6 3 D110H Екзон 4 0.39
7 6 621+1 G-A Екзон 4 0.77
8 3 574 delA Екзон 4 0.39
9 2 L137P Екзон 4 0.26
10 1 G126A Екзон 4 0.13
11 11 Q220X Екзон 6а 1.41
12 1 K246T Екзон 6а 0.13
13 24 R347P Екзон 7 3.08
14 1 R334W Екзон 7 0.13
15 1 R334Q Екзон 7 0.13
16 3 5Т Интрон 8 0.39
17 490 F508del Екзон 10 62.98
18 9 1677delTA Екзон 10 1.15
19 1 Q493R Екзон 10 0.13
20 1 1716+1 G-A Интрон 10 0.13
21 2 1717-8 A-G Интрон 10 0.26
22 27 G542X Екзон 11 3.47
23 1 L571S Екзон 12 0.13
24 2 1898+3 G-A Интрон 12 0.26
25 9 2184 insA Екзон 13 1.15
26 1 2176 ins C Екзон 13 0.13
27 16 2183 A A-G Екзон 13 2.95
28 1 Е831Х Екзон 14а 0.13
29 6 2789 +5 G-A Интрон 14b 0.77
30 2 G1069R + L88X Екзони 17b и 3 0.26
31 10 R1070Q Екзон 17b 1.28
32 1 R1158X Екзон 19 0.13
33 1 N1195T Екзон 19 0.13
34 15 3849+ 10kb Интрон 19 1.92
35 9 W1282X Екзон 20 1.15
36 5 G1244V + S912L Екзони 20 и 15 0.64
37 2 G1244E Екзон 20 0.26
37 33 N1303K Екзон 21 4.24
38 3 4374 + 1 G-A Екзон 23 0.39
67 неизяснени 8.56
Общо 782
алела
Голяма част от описаните над 336 варианта или полиморфизми, както по-често са наричани, обикновено не променят кодиращите и регулаторни участъци или засягат такива аминокиселинни последователности, които според локализацията не са силно консервативни и не се свързват с клинични симптоми. Според ефекта върху белтъчния продукт молекулните дефекти могат да бъдат обособени в шест класа (таблица 2)8.
Таблица 2. Класификация на мутациите в CFTR гена според ефекта върху белтъчния продукт
Клас
Ефект върху функциите на белтъка
Пример за молекулен дефект
I
Скъсен белтъчен продукт Това са различни молекулни дефекти, водещи до преждевременна поява на стоп кодон – например W1282X
II
Белтъкът не може да достигне клетъчната мембрана С подобен ефект е най-честата мутация ДF508del и някои други – S945L, H949Y, D979A
III
Пропускливостта на канала не се регулира правилно G551D A – (аминокиселината глицин е заменена с аспартат),
IV
Намалена хлоридна проводимост на канала R117H, G622D, M1137V, I1139V, D1152H, D1154G
V
Намален синтез на нормален белтъчен продукт, обикновено свързан с неправилно процесиране A455E, екзон 8 Tn, 1717-9T- C, D565G
VI
Нестабилност на белтъчния продукт Q1412X, 4326delTC, 4279insA, 4271delC
Приема се, че клас I, II и III имат по-сериозен ефект върху белтъчната функция и са свързани с по-тежки клинични прояви на болестта. При останалите класове мутации може да се очаква по-леко протичане на болестта. От описаните при българските пациенти с муковисцидоза молекулни дефекти 7 от тях водят до преждевременна поява на стоп кодон и спадат към клас I. Останалите мутации трудно могат да бъдат класифицирани, като се има предвид, че става въпрос за редки дефекти, при които не са провеждани по-подробни проучвания.
Връзка между генетичните дефекти и фенотипните характеристики на заболяването
Генетичните анализи при наследствените болести са неотменна част от диагностичния процес и подходите за тяхната профилактика. От една страна те позволяват да се потвърди клиничната диагноза, особено когато не всички критерии са налице. При муковисцидоза се срещат редица проблеми, свързани с оценката на нивото на електролити в потта, особено при новородените и кърмачетата. По-леките или липсващи симптоми от страна на белия дроб или панкреаса също могат да затруднят клиничната диагноза. Тук трябва да се обърне внимание, че генетичните анализи помагат да потвърдят клиничната диагноза (или насочват към възможността при пациента с времето да бъдат регистрирани дадени симптоми), но не могат категорично да я изключат. Определянето на молекулните дефекти при даден пациент в някои случаи позволява да се направи прогноза за хода на болестта. Има редица проучвания, целящи да се установят връзките между генотипа и фенотипните характеристики на муковисцидозата. Почти без изключение данните сочат, че точна прогноза не може да бъде направена. Ако по отношение генетичната основа можем да кажем, че муковисцидозата е болест с менделов тип унаследяване, то по отношение на фенотипа се изправяме пред ефекта от влиянието на множество фактори. В това число можем да посочим навременното диагностициране, терапия, социална среда и други културални условия и, не на последно място, действието на гени модификатори9. Това обяснява защо при пациенти с един и същи генотип, дори такива, които принадлежат към едно и също семейство, могат да бъдат отбелязани значителни различия в протичането на болестта. Последни проучвания сочат, че отношение към развитието на заболяването има и полът на пациента10. Сравнение на тежестта на симптомите при момичета и момчета, диагностицирани в детството, показва по-добра прогноза при пациентите от мъжки пол.
Първите симптоми на муковисцидозата не рядко са от страна на гастроинтестиналния тракт. Едно от ранните неонатални усложнения е мекониум илеус. Едно от проучванията при български пациенти11 показва, че в много случаи тази находка не се дължи на дефекти в CFTR гена. Установените мутации при доказаните случаи на муковисцизода с мекониум илеус за нашата популация спадат към групата на честите и тежки молекулни дефекти.
През последните години ултразвуковата диагностика по време на бременност насочи към връзката между мекониалните перитонити и хиперехогенността на чревните бримки при плода и риска от муковисцидоза12. Като цяло литературните данните показват, че при сравнително малка част от бременностите са регистрирани молекулни дефекти в CFTR гена и бременността е определена като рискова за раждане на дете с муковисцидоза. През последните две години към Национална генетична лаборатория бяха насочени 14 случая с ехографска находка на хиперехогенност на чревни бримки. В подобни случаи бременната не се насочва директно за дородова диагностика, а се извършва предварително изследване за носителство при партньорите. Само ако се разкрие носителски статус, може да се обсъжда инвазивна манипулация с оглед изясняване на статуса при плода. При насочените към Националната генетична лаборатория случаи не беше установен носителски статус при родителите, както и не беше регистриран в последствие случай на раждане на дете с муковисцидоза в семейството.
При една част от пациентите може да не се наблюдават класическите симптоми на болестта. Обикновено се регистрира по-слабо засягане на панкреатичните функции и гранични или даже нормални стойности на електролити в потта. Генетичните анализи при такива пациенти обикновено регистрират алели, носещи мутации, които могат да се определят от клас V или VІ, и са свързани основно с алтернативни варианти на снаждане или намалена стабилност на белтъчния продукт. При българските пациенти един от често срещаните молекулните дефекти, свързан с късно начало и обикновено нормални или гранични потни тестове, е мутацията 3849+10KB.
Друга група пациенти, при които се дискутира генетично изследване на CFTR гена, са тези с обструктивна азооспермия. При наличие на мутация, свързана с нарушение в регулацията в съчетание с друг молекулен дефект или вариант (полиморфизъм) в гена, най-често липсват характерните клинични симптоми на болестта, като показанията са свързани единствено с репродуктивни проблеми. Ето защо е изключително важно при такава находка двойката, която обикновено се насочва за асистирана репродукция, да бъде анализирана и за носителство на дефекти в CFTR гена. Намерените при български пациенти с обструктивна азооспермия варианти обикновено съчетават носителство на алел с F508del в комбинация с друг регулаторен дефект (най-често 5Т варианта в интрон 8).
Генетичните дефекти при муковисцидоза и връзката им с лечението на болестта
Доказването на генетични дефекти при пациентите с муковисцидоза дава възможност да се разработват все по-ефективни подходи за лечение, основани на спецификите на конкретната молекулна патология. Така, ориентирайки се около основните класове мутации според тяхното действие върху белтъчния продукт, се търсят начини как проблемът да бъде коригиран или заобиколен по алтернативен път. При мутациите от клас І основният проблем е синтезът на скъсен нефункционален белтък заради преждевременната поява на „стоп” кодон. Специфичен терапевтичен подход предлага възможност да не се изчита правилно такъв „стоп” кодон. Доказано е, че аминогликозидните антибиотици могат да взаимодействат с аминоацитал (A) мястото на рибозомалната РНК и, променяйки конформационно антикодон свързването, да свържат която и да е транспортна РНК и белтъчният синтез да стигне до края13. Такъв подход е изпробван и върху пациенти с муковисцидоза, като резултатите показват положителни промени в хлоридния транспорт14. Около 12% от пациентите в България имат алели с такъв тип молекулен дефект и клинично проучване в тази насока определено представлява интерес.
В основата на молекулната патология на най-честата мутация F508del (спадаща към молекулни дефекти от клас ІІ) лежи невъзможността на белтъчния продукт да премине през Апарата на Голджи и да достигне апикалната мембрана. Вследствие на това той бива подложен на деградация. Ако белтъчният продукт, носещ делетиралата на 508 позиция аминокиселина фенилаланин, достигне клетъчната мембрана, той може да функционира нормално. Стабилизирането на такъв погрешно нагънат белтъчен продукт става с участието на различни шаперони, присъстващи в ендоплазматичния ретикулум (например 70-kDa HSPs, включващ Hsp70 и Hsc70)15.
Други молекулярни шаперони, като калнексин, спомагат за правилното му нагъване. Едно химично съединение, използвано при лечение на заболявания на урейния цикъл ( 17 Sodium- 4-phenylbutyrate (4-PBA) ), може да помогне за транспорта на носещия делецията белтъчен продукт до плазмената мембрана. Тези проучвания са все още в изпитателна фаза, въпреки че има данни за измерена активност на CFTR в носни епителни клетки16.
Генетичните анализи при пациентите с муковисцидоза съдържат важна информация, която в настоящия момент е ориентирана основно към прогнозиране хода на болестта или потвърждаване на клиничната диагноза, но съвсем скоро ще послужи и за разработването на индивидуални подходи за терапия и значително подобряване на качеството на живот.
Литература:
1. Riordan, J. R., Rommens, J. M., Kerem, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 245: 1066-1073, (1989).
2. Cystic Fibrosis Mutation Base, www.genet.sickkids.on.ca/cftr www.genet.sickkids.on.ca/cftr
3. Morral N, Bertranpetit J, Estivill X, Nunes et al. The origin of the major cystic fibrosis mutation (ΔF508) in European populations. Nature Genet; 7:169–175. (1994)
4. Xavier Estivill, Consol Bancells, Cristina Ramos, and the Biomed CF Mutation Analysis Consortium. Georraphic Distribution and Regional Origin of 272 Cystic Fibrosis Mutations in European Populations. Human Mutation 10: 135-154 (1997).
5. Savov A., Angelicheva D., Balassopoulou A., et al. Double mutants alleles: are they rare? Hum. Mol. Genet. vol 4 p. 1169-1171, (1995).
6. Dora Angelicheva, Francesc Calafel, Alexey Savov, et al. Cystic Fibrosis mutations and associated haplotypes in Bulgaria – Comparative population genetic study. Human Genetics 99: pp. 513-520 (1997).
7. Angelicheva D., Boteva K., Jordanova A., et al. Cystic fibrosis patients from the Black sea region: The 1677delTA mutation. Human Mutations, vol 3 No 4 p. 353-357, (1994).
8. A. Peebles, G. Connett, J. Maddison and J. Gavin. “Cystic Fibrosis Care: A Practical Guide” Chapter 3Elsevier. (2005) .
9. Boyle MP. Strategies for identifying modifier genes in cystic fibrosis. Proc Am Thorac Soc. Jan;4 (1):52-7 (2007).
10. Nick JA, Chacon CS, Brayshaw SJ, et al. Effects of gender and age at diagnosis on disease progression in long-term survivors of cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. Sep 1;182(5):614-26. (2010).
11. Angelicheva D., Boteva K., Savov A., et al. Meconium ileus in Bulgaria: A molecular study. Balk. J. of Clin Lab. vol 3, p. 38 – 42, (1994).
12. Scotet V, De Braekeleer M, Audrézet MP, et. al. Prenatal detection of cystic fibrosis by ultrasonography: a retrospective study of more than 346 000 pregnancies. J Med Genet. Jun;39(6):443-8. (2002).
13. Holbrook JA, Neu-Yilik G, Hentze MW, Kulozik AE. Nonsense-mediated decay approaches the clinic. Nat Genet. Aug;36(8):801-8. (2004).
14. Wilschanski M, Famini C, Blau H, et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in cystic fibrosis patients carrying stop mutations. Am J Respir Crit Care Med. Mar;161(3 Pt 1):860-5. (2000).
15. Kerem E. Mutation specific therapy in CF. Paediatr Respir Rev.;7 Suppl 1:S166-9. (2006).
16. Rubenstein RC, Zeitlin PL. A pilot clinical trial of oral sodium 4-phenylbutyrate (Buphenyl) in deltaF508-homozygous cystic fibrosis patients: partial restoration of nasal epithelial CFTR function. Am J Respir Crit Care Med. Feb;157(2):484-90. (1998).